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Il "tempo equivalente" F: significato ed applicazioni pratiche

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Il concetto di tempo equivalente, se usato in modo corretto, è molto utile nel controllo del processo di sterilizzazione. F, inteso come misura della letalità di un processo di sterilizzazione termica in funzione del tempo, può essere calcolato sia a partire da parametri fisici che biologici. In questo articolo analizzeremo le definizioni di F, i metodi di calcolo e i campi di applicazione, per poi andare ad esaminare alcuni casi concreti di utilizzo di F nella sterilizzazione a calore umido.

A cura di L. Maita (Fedegari Group)

Introduzione 

Il concetto di tempo equivalente, o semplicemente F, è stato introdotto per la prima volta dalla National Canners Association nel 1968 (1) e successivamente ripreso dalla Food and Drug Administration (FDA) con la Proposed Rule 212 del 1° Giugno del 1976 (2).
Largamente utilizzato dalle industrie farmaceutiche nel trattamento di sostanze termolabili, ad esso sono dedicati paragrafi nelle principali legislazioni di settore, quali la farmacopea europea (European Pharmacopoeia, EP) e quella americana (United States Pharmacopeia, USP). Grazie al concetto di tempo equivalente è infatti possibile calcolare la durata o valutare l’effetto di un processo di sterilizzazione ad una data temperatura, la cui letalità sia uguale a quella di un processo analogo di cui sia nota la durata a una temperatura scelta come riferimento.

Il tempo equivalente di sterilizzazione

Lo scopo di un processo di sterilizzazione è quello di ridurre la carica microbica presente sul prodotto, in modo da poter garantire uno Sterility Assurance Level (SAL) almeno uguale a 10-6, come prescritto dalla EP (3). In questo modo si raggiunge la probabilità di avere un’unità contaminata (non sterile) sarà inferiore o uguale a uno su un milione.
Il tradizionale approccio europeo alla sterilizzazione basato sul controllo di tempo e temperatura prevede l’esposizione del carico da trattare in condizioni di vapore saturo, a 121 °C per 15 minuti calcolato nel punto più freddo della camera (3). Queste condizioni possono però risultare inapplicabili nel caso in cui il prodotto da sterilizzare sia termolabile; da qui la necessità di sviluppare un metodo di controllo alternativo.
Viene introdotto il concetto di tempo equivalente, come strumento matematico che consenta di calcolare il tempo di sterilizzazione di processi operati a temperature diverse da quella di riferimento (121°C) o rispetto ad altri operati ad una temperatura nota. Come indicato nel Technical Report No.1 del PDA “The F-value is a measurement of the lethality of a process” (4). Il calcolo del tempo equivalente fornisce quindi la “letalità” (lethality) di un processo, e viene espresso in minuti (5).
Durante la messa a punto di un processo di sterilizzazione è essenziale prendere in considerazione anche le caratteristiche della specie microbica contaminante, cioè del bioburden presente sul prodotto. In quest’ottica vengono introdotti i parametri D e z, di fondamentale importanza per poter calcolare il tempo equivalente del processo di sterilizzazione. 
È opportuno ricordare che ha senso parlare di tempo equivalente solo quando è rispettata la condizione essenziale di un processo di sterilizzazione a calore umido, ovvero la presenza di vapore condensante in contatto col prodotto.
Il parametro D, detto anche tempo di riduzione decimale, consente di esprimere quantitativamente la resistenza al calore di una particolare specie microbica per uno specifico trattamento di sterilizzazione. Come riportato nel capitolo 1229.2 della USP “The D-value is the time (customarily in minutes) required to reduce the microbial population by 90% or 1 log10 cycle (i.e., to a surviving fraction of 1/10) and must be associated with the specific lethal conditions at which it was determined” (6). 
Ovvero: il valore di D è il tempo in minuti necessario per ridurre la popolazione microbica ad un decimo del suo valore iniziale. È importante sottolineare che il valore D deve sempre essere associato alle condizioni di letalità, vale a dire le condizioni di temperatura del processo di sterilizzazione, a cui è stato determinato. 
Sperimentalmente il valore di D dipende dalla temperatura del processo di sterilizzazione. Come mostrato nella Figura 1, la resistenza di un microrganismo aumenta se la temperatura del processo diminuisce e, viceversa, diminuisce quando si utilizza una temperatura più elevata. 

Fedegari 1 19

Figura 1 - Rappresentazione della variazione dei valori di D, su scala semilogaritmica, in funzione della temperatura T: relazione inversa temperatura/resistenza di un microrganismo (4).

Strettamente legato al parametro D, ed importante ai fini del calcolo del tempo equivalente di sterilizzazione, è il coefficiente di temperatura z. Esso, infatti, consente di esprimere la variazione della resistenza di un particolare microrganismo in funzione della temperatura di processo. Il parametro z è specifico per una determinata specie microbica e si riferisce ad un campo di temperatura ben definito. Come riportato nel capitolo 1229.2 della USP, “The z-value is defined as the number of degree of temperature change necessary to change the D-value by a factor of 10” (6). Si definisce quindi come z la variazione di temperatura, espressa in °C, necessaria per variare di dieci volte il valore di D, aumentandolo se la temperatura decresce, riducendolo se la temperatura aumenta. 
In assenza di dati sperimentali, si assume abitualmente che il valore di z sia uguale a 10° C.

Abbiamo ora tutti gli strumenti per poter calcolare il tempo equivalente di sterilizzazione

Modalità per il calcolo del tempo equivalente

Utilizzando l’equazione per il calcolo del tempo equivalente F, potremo ricavare la durata del processo di sterilizzazione ad una data temperatura, necessario per ottenere una letalità uguale a quella di un processo operato nelle condizioni di riferimento. In tal modo ci assicureremo la stessa riduzione della popolazione microbica. Il valore di F è calcolato utilizzando la seguente formula:

Fedegari Formula 1 

Dove:
Δt = intervallo di tempo tra due misurazioni successive
T = temperatura reale di sterilizzazione
Tref = temperatura di riferimento
z = coefficiente di temperatura

Quando la temperatura di riferimento Tref è uguale a 121 °C ed il valore del parametro z è pari a 10 °C, il tempo equivalente è chiamato F0 ed è calcolato utilizzando la seguente formula:

Fedegari Formula 2

È possibile confrontare la letalità di processi di sterilizzazione operati a temperature differenti, tramite il calcolo dei relativi F0. Per esempio, consideriamo due processi aventi entrambi una durata di 15 minuti: il primo è eseguito alla temperatura di riferimento (121°C), mentre il secondo a 111°C. Nel primo caso avremo un F0 uguale a 15 minuti, e nel secondo caso un F0 uguale a 1,5 minuti. È evidente che, a parità di tempo di esposizione, la letalità impartita dal processo, di cui F0 è la misura, è minore se la temperatura è più bassa. In altre parole, il tempo equivalente F sarà sempre minore di quello di esposizione se la temperatura utilizzata
è inferiore a quella di riferimento, e viceversa. L’utilizzo di F appare dunque significativo poiché fornisce una relazione tra la temperatura di sterilizzazione, il tempo di esposizione e l’effetto impartito al prodotto. Al valore di F così calcolato, partendo da dati fisici misurati durante il processo di sterilizzazione, quali la temperatura ed il tempo, ci si riferisce come F fisico (FPHY). Nella Farmacopea Europea, oltre al concetto di F fisico, si definisce anche quello di F biologico (FBIO) come “the lethality, in minutes, provided by the process in terms of destruction of the biological indicators used” (3). Il valore di FBIO risulta dalla seguente equazione:

Fedegari Formula 3

Dove:
D121 = parametro D alla temperatura del processo di sterilizzazione
N0 = numero di microrganismi vitali prima del processo
N = numero di microrganismi vitali alla fine del processo

Il valore di FBIO, può essere interpretato come il tempo equivalente necessario per ottenere ad una data temperatura di processo una desiderata riduzione di una determinata popolazione microbica. In quest’ottica, affinché il ciclo di sterilizzazione raggiunga il suo scopo, ovvero la riduzione fino ad un livello definito della popolazione che inizialmente contaminava il prodotto è necessario che il valore di FPHY sia sempre maggiore o uguale a quello del FBIO. Così facendo si avrà la certezza che il processo è in grado di impartire la letalità necessaria a garantire la riduzione della popolazione microbica contaminante ed il raggiungimento del corretto SAL.

Controllo del processo di sterilizzazione

Come già detto in precedenza, un processo di sterilizzazione può essere controllato dal tempo o mediante il calcolo del fattore F0. Ovviamente, ciò che ci guida nella scelta è dipendente dalle caratteristiche intrinseche del prodotto da sterilizzare. Ad esempio, l’utilizzo di un processo a tempo è indicato per la maggior parte dei carichi solidi, dei carichi porosi o per quei prodotti le cui caratteristiche intrinseche non vengano danneggiate dalla temperatura e dal tempo di sterilizzazione. A differenza dei processi controllati sulla base del tempo, il processo di sterilizzazione controllato mediante F0 permette di calcolare la letalità accumulata anche durante
parte delle fasi di riscaldamento e di raffreddamento, oltre che nella fase di sterilizzazione. Il risultato sarà quello di sviluppare un processo che tiene conto della letalità accumulata a temperature più basse rispetto a quella di sterilizzazione, seppur efficaci al fine dell’abbattimento della carica microbica, riducendo di conseguenza il tempo di esposizione del prodotto e prevenendone la sua possibile degradazione o il suo danneggiamento. Secondo quanto indicato nella farmacopea europea, “a reduced cycle is chosen such that the temperature is not more than 1 z-value below the reference sterilization process temperature” (7), quindi è logico ed opportuno iniziare il calcolo del tempo equivalente solo ad una temperatura Tref-z, perché al di sotto di questa il valore di D non è noto.

Utilizzo dell’F0 nel processo di sterilizzazione

Affinché abbia senso parlare di tempo equivalente, è necessario che siano rispettate le condizioni essenziali della sterilizzazione. Ad esempio, nel caso di un processo a calore umido, il carico da sterilizzare dovrà sempre essere in contatto con acqua allo stato liquido (vapore condensante e temperatura). Se questa condizione manca, il calcolo del tempo equivalente perde ogni significato. La sterilizzazione di prodotti contenenti liquidi soddisfa intrinsecamente questo requisito, essendo l’acqua presente nel corpo dell’oggetto da sterilizzare (bulk sterilization) (5).
Un esempio di quanto descritto si ha nel caso della sterilizzazione di sostanze termolabili, come l’acido ialuronico. L’esposizione di questo prodotto per un tempo o ad una temperatura inadeguata potrebbe danneggiare la molecola, anche creando sottoprodotti di degradazione. Dal lato opposto si rischia di non raggiungere un livello di sterilità adeguato. Pertanto, nello studio di un processo di sterilizzazione più idoneo, controllato tramite F0, si è provveduto ad effettuare diverse prove che consentissero di raggiungere lo stesso valore di letalità utilizzando temperature differenti. L’analisi dei risultati, che comprendeva la valutazione di parametri fisici quali la viscosità del prodotto al termine del trattamento, ha evidenziato come l’utilizzo di temperature di processo più basse (115°C e 121°C) abbia portato ad un maggiore deterioramento del prodotto. Invece, utilizzando una temperatura di processo più elevata (130°C) ed esponendo il prodotto per molto minor tempo, si riduce l’entità della degradazione pur raggiungendo lo stesso livello di letalità. (vedi Figura 2) (8)

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Fig. 2: Caratterizzazione reologica dei campioni trattati a diverse temperature di sterilizzazione a parità di F0. Le curve di flusso sono state generate mediante la misurazione della viscosità dinamica (η) a velocità di rotazione crescente (sforzo di taglio γ) utilizzando un reometro a cono piatto (8).

Possibili approcci al trattamento di sostanze termolabili possono inoltre includere, ad esempio, la minimizzazione della carica microbica del prodotto, in modo da ridurre il tempo di processo richiesto per raggiungere un SAL adeguato. 
Nel caso di carichi solidi porosi, la presenza di vapore saturo a contatto costante delle superfici da sterilizzare richiede la rimozione dell’aria inizialmente a contatto del carico. Si parla quindi di surface sterilization. La raggiunta corrispondenza tra la temperatura e la pressione di saturazione del vapore è però condizione necessaria ma non sufficiente per dimostrare la completa rimozione dell’aria. La difficoltà nella verifica di questo requisito ci spinge ad un’impostazione ancor più rigorosa, nella quale il calcolo della letalità del processo comincia solo all’ingresso nel plateau period, cioè nella fase di sterilizzazione. Le fasi di raffreddamento e asciugamento, inoltre, fanno venir meno istantaneamente il requisito del contatto tra vapore saturo e superfici da sterilizzare: l’uso del tempo equivalente nella sterilizzazione di solidi porosi assume quindi il significato
di un generico controllo aggiuntivo (5).

Bibliografia

(1) National Canners Association “Laboratory manual for food canners and processors”, Vol.1, AVI Publishing Co., Westport, CT, 1968
(2) F.D.A. “Current Good Manufacturing Practices in Manufacture, Packaging or Holding of LVPs”, Proposed rules for 21 CFR part 212, Federal
Register, Vol. 41, No. 106, June 1, 1976 (Repealed 1992)
(3) European Pharmacopoeia 9.2 Supplement Implementation: 7/2017, Capitolo 5.1.1 “Methods of preparation of sterile products”
(4) PDA Technical Report No. 1, Revised 2007, Validation of Moist heat sterilization Processes: Cycle Design, Development, Qualification and Ongoing
Control, PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, Volume 61, No. S-1
(5) Mascherpa V., Highlights on equivalent time, Fedegari Group, 2014
(6) United States Pharmacopeia Edizione 41- NF36, Capitolo 1229.2 “Moist Heat Sterilization of Aqueous Liquids”
(7) European Pharmacopoeia 9.2 Supplement Implementation: 7/2017, Capitolo 5.1.2 “Biological Indicators and related microbial preparation used in
the manufacture of sterile products.”
(8) Bernuzzi M. L. e Giori A., An innovative way to thermally sterilize hyaluronic acid pre-filled syringes, Fedegari Group, 2016

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Pubblicato in Ascca News 1/2019

Ultima modifica il Giovedì, 14 Marzo 2019 16:11
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